枳實과 紫花地丁 복합제(PVC)가 TNF-α로 염증 유도된 HUVEC에 미치는 항염증 효과

Anti-Inflammatory Effects of Poncirus trifoliata and Viola mandshurica Complex on TNF-α-Induced Inflammation in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Article information

J Int Korean Med. 2025;46(4):926-939

Publication date (electronic) : 2025 September 30

doi : https://doi.org/10.22246/jikm.2024.45.6.926

Hyun-ji Kim ¹, Do-yeon Kim ², Sang-yoon Jeon ¹

김현지¹, 김도연², 전상윤¹

¹ 동신대학교 한의과대학 내과학교실

¹ Dept. of Internal Medicine, College of Korean Medicine, Dongshin University

² 동신대학교 한의과대학 침구학교실

² Dept. of Acupuncture & Moxibustion Medicine, College of Korean Medicine, Dongshin University

·교신저자: 전상윤 전라남도 나주시 교육길 14 동신대학교 나주한방병원 한방내과 TEL: 061-338-7812 FAX: 061-338-7807 E-mail: damiano70@hanmail.net

․이 논문은 2025년도 동신대학교 대학원 한의학 석사학위 논문임.

Received 2025 September 1; Revised 2025 October 8; Accepted 2025 October 8.

Abstract

ABSTRACT

Objective:

This study investigated the anti-inflammatory effects of Poncirus trifoliata Rafinesque and Viola mandshurica Baker Complex (PVC) on tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)-induced inflammation in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).

Methods:

HUVECs were pretreated with PVC and subsequently stimulated with TNF-α. The mRNA and protein expression levels of IL-6, iNOS, eNOS, KLF2, IL-8, MCP-1, ICAM-1, and VCAM-1 were quantitatively analyzed. Additionally, phosphorylation levels of ERK, JNK, and p38 were assessed.

Results:

PVC significantly reduced the mRNA and protein expression levels of IL-6, iNOS, MCP-1, ICAM-1, and VCAM-1 compared to the controls while increasing the expression of eNOS and KLF2. No significant effect was observed on IL-8 expression. Furthermore, PVC markedly decreased the phosphorylation levels of ERK, JNK, and p38 relative to the controls.

Conclusions:

PVC can protect vascular endothelial cells from inflammatory damage, which may prevent cardiovascular disease by inhibiting vascular inflammation associated with atherosclerosis.

Keywords: Poncirus trifoliata Rafinesque and Viola mandshurica Baker complex; human umbilical vein endothelial cells (HUVECs); anti-inflammatory effect; atherosclerosis; cardiovascular diseases (CVDs)

Ⅰ. 서 론

세계보건기구(WHO)에 따르면, 심혈관 질환(Cardiovascular Diseases, CVDs)은 2000년 이후 20년간 전 세계 사망원인 중 가장 높은 비중을 차지해 왔으며1, 2019년에는 전 세계 사망자의 약 32%에 해당하는 약 1,790만 명이 심혈관 질환으로 사망한 것으로 추정된다2. 따라서 심혈관 질환으로 인한 사망률 증가 추세는 효과적인 예방 및 치료 전략의 필요성을 더욱 부각시키고 있다1,2.

죽상경화증(Atherosclerosis)은 혈관 내막에 콜레스테롤 침착, 염증성 침윤, 섬유성 기질 등의 비정상적 축적이 일어나 혈관 내경과 탄성을 감소시키는 만성 염증성 질환이다3. 죽종(atheroma), 혹은 죽상판(atheromatous plaque) 형성을 특징으로 하며, 특히, 죽상판이 파열될 경우 혈전 형성을 유발하여 심근경색, 동맥류 및 뇌경색 등 치명적인 심혈관 질환을 초래할 수 있는 가장 중요한 병리 기전으로 알려져 있다3,4.

죽상경화증의 발생은 혈관 내피세포의 기능 이상에서 시작되며, 이 과정에서 유도되는 염증 반응이 핵심적인 병리적 메커니즘으로 인식되고 있다5,6. 주요 위험요인으로 고혈압, 당뇨병, 흡연, 이상지질혈증 등이 알려져 있으며, 역학 연구에 따르면 2010년부터 10년간 고혈압과 당뇨의 유병률 및 흡연율은 큰 변화가 없거나 감소한 반면, 이상지질혈증의 유병률은 2005년 이후 지속적으로 증가하고 있다5,7. 또한, 죽상경화증은 재발 위험이 높으며, 일단 발병하면 조절이 어렵기 때문에, 발병 이전 단계에서 위험 인자 관리가 심혈관 질환 예방 및 치료의 핵심으로 강조된다8,9.

현재 죽상경화증의 예방 및 치료는 생활 습관 교정과 약물치료에 기반하고 있으며, 직접적인 병변 치료보다는 죽상경화증의 위험인자인 콜레스테롤 수치 조절에 초점이 맞춰져 있다8. 그러나 기존 치료 약물이 총콜레스테롤 또는 LDL-C(Low Density Lipoprotein Cholesterol) 농도를 효과적으로 낮출 수 있음에도 불구하고, 복통, 속쓰림, 오심, 구토 등의 위장관 장애를 비롯하여 두통, 불면 등의 부작용이 발생한다는 보고가 있어 안전하고 효과적인 천연물 기반 제제의 개발 필요성이 대두되고 있다8,9.

枳實은 性味가 苦･寒･辛･酸하고 破氣消積, 化痰散結하는 효능이 있어10, 임상적으로 알레르기 질환, 피부질환, 암, 위장장애를 비롯한 각종 염증성 질환에 활용되어 왔다11. 현대 약리학적 연구에서도 枳實의 항암12, 항염증13, 항알레르기14, 위장관 운동 촉진15 등의 효과가 보고되었으며, 이상지질혈증 억제 효과에 대한 실험연구도 보고된 바 있다16.

紫花地丁은 性味가 苦･辛･寒하고 無毒하며 淸熱解毒, 凉血消腫의 효과를 가지고 있으며10, 주로 화농성 염증 질환, 염증성 소화기 질환, 독사 등에 의한 교상 등에 활용되어 왔다17. 최근에는 항염증18, 항알레르기19 효능 및 죽상경화증 억제 가능성20이 보고되어, 그 활용 가치가 주목받고 있다.

枳實과 紫花地丁은 각각 항염증, 지질대사 조절과 관련된 효능이 확인되었지만12-16,18-20, 枳實과 紫花地丁 복합제(Poncirus trifoliata Rafinesque and Viola mandshurica Baker Complex, PVC)의 효능에 대한 연구는 미비한 실정이다. 이에 본 저자는 PVC의 혈관 내 항염증 효과를 확인하고자 본 연구를 진행하였다.

본 연구에서는 인간 탯줄 정맥 내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)를 활용하여 PVC가 혈관내피세포 염증 반응에 관련 인자들의 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향을 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 연구 재료 및 방법

1. 시료 및 추출

본 연구에 사용된 枳實과 紫花地丁 복합제(Poncirus trifoliata Rafinesque and Viola mandshurica Baker Complex, PVC)의 구성 약재는 한약재 유통업체인 (주) 옴니허브에서 제조된 한약재 규격품을 구입하여 사용하였으며, 그 구성은 아래와 같다(Table 1). 먼저 1첩 분량의 PVC(40 g)에 1 L의 증류수를 넣고 100 °C에서 3시간 동안 extraction mantle (Misung Scientific, Korea)를 사용하여 추출하였으며, 여과지를 사용하여 추출물을 여과하였다. 여과된 추출물은 rotary vacuum evaporator(EYELA, Japan)를 사용하여 감압농축하고 freeze dryer (ilShinbiobase, Korea)를 사용하여 동결건조를 진행하였다. 동결건조 완료 후, PVC는 12.15 g(수득률: 30.38%)의 분말을 획득하였고 -20 °C에 보관하면서 실험 당일 소분하고 증류수에 용해시켜 사용하였다.

Table 1

The Prescription of PVC

2. 세포 배양

인간 탯줄 정맥 내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)는 Lonza(Switzerland)에서 분양받아 사용하였고, EGM™-2 Medium과 EGM™-2 SingleQuots™ kit(Lonza, USA)로 혼합된 배지를 사용하여 37 °C, 5% CO₂ 조건이 유지되는 세포 배양기(Sanyo, Japan)에서 배양하였다. 세포의 계대 배양은 2-3일 주기로 진행하였으며, 실험에 사용되는 모든 plate는 0.2% gelatin solution (Sigma-Aldrich, USA)으로 30분간 코팅한 후 PBS로 세척하여 사용하였다.

3. 세포 생존율 측정

HUVEC을 48-well plate에 1 × 10⁵ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였으며, 24시간 후, PVC를 100, 200, 400, 600 µg/mL의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후, 각 well당 20 µL의 EZ-Cytox(DoGenBio, Korea) 용액을 첨가하여 세포 배양기에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 microplate reader(Molecular Devices, USA)의 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포생존율은 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.

4. 유전자 발현량 측정

HUVEC을 6-well plate에 1 × 10⁶ cells/well로 분주하여 배양하였으며, 24시간 후, PVC를 100, 200, 400 µg/mL 농도로 1시간 동안 전처리한 후, human TNF-α(Sigma-Aldrich, USA)를 10 ng/mL로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후, 원심분리하여 얻은 세포는 total RNA prep kit(Intronbio, Korea)를 사용하여 RNA를 추출하였으며, 추출한 RNA는 reverse transcription premix (Bioneer, Korea)와 혼합하고 PCR cycler (PCRmax, UK)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 특정 유전자를 증폭시켜 확인하기 위해 real-time PCR을 진행하였으며, cDNA와 특정 유전자에 맞는 primer, SYBR green premix(Qiagen, Germany)를 혼합하고 real-time PCR cycler (Rotor-Gene Q: Qiagen, Germany)를 사용하여 특정 유전자를 증폭시켰다. 유전자 발현량은 대조군의 유전자 발현량을 기준으로 상대정량 하였으며, 사용된 primer들의 정보는 Table 2와 같다.

Table 2

Real-Time PCR Primer Sequences

5. 단백질 발현량 측정

HUVEC을 6-well plate에 1 × 10⁶ cells/well로로 분주하여 배양하였으며, 24시간 후, PVC를 100, 200, 400 µg/mL 농도로 1시간동안 전처리한 후, human TNF-α(Sigma-Aldrich, USA)를 10 ng/mL로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후, 원심분리하여 얻은 세포는 protease 및 phosphatase inhibitor(Sigma-Aldrich, USA)가 포함된 RIPA buffer를 넣어 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 BCA protein assay kit(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 정량하고 sample loading buffer와 혼합하여 95 °C에서 5분간 반응시켜 준비하였다. 준비된 단백질은 10% acrylamide gel을 사용하여 SDS-PAGE로 크기별로 분리하였고, PVDF membrane에 이동시켰다. 단백질이 옮겨진 membrane은 3% BSA에 담가 상온에서 2시간 동안 반응시켜 blocking을 진행하였으며, TBS-T buffer로 세척하고 각 primary antibody(Cell Signaling Technology, USA)와 4 °C에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 membrane을 세척하고 secondary antibody(Jackson ImmunoResearch, USA)와 상온에서 1시간 동안 반응시켰으며, 이를 다시 세척하여 ECL solution (iNtRON Biotechnology, Korea)으로 특정 단백질을 발색시켰다. 발색 후, chemidoc fusion FX(VILBER, France)를 사용하여 단백질 발현량을 분석하였다.

6. 통계처리

연구 결과는 mean±standard deviation으로 나타내었고, SPSS Statistics Version 21.0(IBM, USA)을 사용하였으며, independent sample t-test를 통해 통계적 비교를 수행하였다. 유의성 검정은 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001로 표기하였다.

Ⅲ. 연구 결과

1. 세포생존율

세포생존율을 측정한 결과, 대조군이 100.00±1.72%로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400, 600 µg/mL의 농도에서 각각 100.34±1.91, 100.42±2.29, 100.48±3.85, 89.49±2.40%로 나타났다. PVC 600 µg/mL 농도에서 90% 이하로 감소하여, 이후 연구에서 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL의 농도로 설정하여 사용하였다(Fig. 1).

Fig. 1

Cell viability of PVC in HUVECs.

HUVECs were treated with PVC (100, 200, 400, and 600 µg/mL) for 24 h. Treated cells were incubated with EZ-Cytox for 30 min and absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader. Cell viability was calculated as a percentage relative to the untreated control group. Data are presented as mean±standard deviation (SD, n=3).

2. 세포 내 유전자 발현량

1) IL-6

세포 내 IL-6 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 0.20±0.04, 대조군에서 1.00±0.00으로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.74±0.10, 0.54±0.09, 0.26±0.09로 나타나 PVC 100 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 2A).

Fig. 2

Effects of PVC on IL-6 (A), iNOS (B), eNOS (C), and KLF2 (D) mRNA expression in HUVECs.

HUVECs were pretreated with PVC (100, 200, or 400 µg/mL) for 1 h, followed by stimulation with hTNF-α (10 ng/mL) for 24 h. mRNA expression levels were measured by qPCR. Data are presented as mean±standard deviation (SD, n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. Control; ++p<0.01, +++p<0.001 vs. Normal. Normal : non-TNF-α-induced HUVECs, Control : TNF-α-induced HUVECs.

2) iNOS

세포 내 iNOS 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 0.25±0.06, 대조군에서 1.00±0.00으로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.86±0.08, 0.72±0.06, 0.67±0.06으로 나타나 PVC 200 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 2B).

3) eNOS

세포 내 eNOS 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 2.99±0.13, 대조군에서 1.00±0.00으로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 1.35±0.16, 1.68±0.12, 2.24±0.03으로 나타나 PVC 200 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 2C).

4) KLF2

세포 내 KLF2 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 5.04±0.24, 대조군에서 1.00±0.00으로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 1.73±0.28, 2.18±0.29, 2.46±0.29로 나타나 PVC 100 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 2D).

5) IL-8

세포 내 IL-8 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 0.06±0.02, 대조군에서 1.00±0.00으로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.97±0.06, 0.96±0.04, 0.95±0.05로 나타나 PVC 실험군 모두에서 대조군에 비해 유의한 변화가 나타나지 않았다(Fig. 3A).

Fig. 3

Effects of PVC on IL-8 (A), MCP-1 (B), ICAM-1 (C), and VCAM-1 (D) mRNA expression in HUVECs.

HUVECs were pretreated with PVC (100, 200, or 400 µg/mL) for 1 h, followed by stimulation with hTNF-α (10 ng/mL) for 24 h. mRNA expression levels were measured by qPCR. Data are presented as mean±standard deviation (SD, n=3). *p<0.05, **p<0.01 vs. Control; ++p<0.01, +++p<0.001 vs. Normal. Normal : non-TNF-α-induced HUVECs, Control : TNF-α-induced HUVECs.

6) MCP-1

세포 내 MCP-1 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 0.33±0.08, 대조군에서 1.00±0.00으로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.99±0.05, 0.73±0.05, 0.51±0.06로 나타나 PVC 200 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 3B).

7) ICAM-1

세포 내 ICAM-1 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 0.28±0.07, 대조군에서 1.00±0.00으로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.73±0.06, 0.57±0.06, 0.39±0.06로 나타나 PVC 100 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 3C).

8) VCAM-1

세포 내 VCAM-1 유전자 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 0.41±0.09, 대조군에서 1.00±0.00으로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.80±0.14, 0.69±0.17, 0.63±0.11로 나타나 PVC 400 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 3D).

3. 세포 내 단백질 발현량

1) IL-6

세포 내 IL-6 단백질 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 0.16±0.04, 대조군에서 1.00±0.05로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.86±0.07, 0.65±0.06, 0.38±0.05로 나타나 PVC 100 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 4A).

Fig. 4

Effects of PVC on IL-6 (A), iNOS (B), eNOS (C), and KLF2 (D) protein expression in HUVECs.

HUVECs were pretreated with PVC (100, 200, or 400 µg/mL) for 1 h, followed by stimulation with hTNF-α (10 ng/mL) for 24 h. Protein expression levels were measured by Western blot. Data are presented as mean±standard deviation (SD, n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. Control; +++p<0.001 vs. Normal. Normal : non-TNF-α-induced HUVECs, Control : TNF-α-induced HUVECs.

2) iNOS

세포 내 iNOS 단백질 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 0.28±0.06, 대조군에서 1.00±0.06으로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.72±0.07, 0.36±0.11, 0.36±0.05로 나타나 PVC 100 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 4B).

3) eNOS

세포 내 eNOS 단백질 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 2.10±0.17, 대조군에서 1.00±0.18로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 1.52±0.19, 1.52±0.16, 1.95±0.17로 나타나 PVC 100 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 4C).

4) KLF2

세포 내 KLF2 단백질 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 5.25±0.51, 대조군에서 1.00±0.27로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 1.34±0.39, 2.13±0.37, 2.39±0.48로 나타나 PVC 200 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 4D).

5) IL-8

세포 내 IL-8 단백질 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 0.06±0.05, 대조군에서 1.00±0.06으로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.99±0.06, 0.97±0.06, 0.96±0.05로 나타나 PVC 실험군 모두에서 대조군에 비해 유의한 변화가 나타나지 않았다(Fig. 5A).

Fig. 5

Effects of PVC on IL-8 (A), MCP-1 (B), ICAM-1 (C), and VCAM-1 (D) protein expression in HUVECs.

HUVECs were pretreated with PVC (100, 200, or 400 µg/mL) for 1 h, followed by stimulation with hTNF-α (10 ng/mL) for 24 h. Protein expression levels were measured by Western blot. Data are presented as mean±standard deviation (SD, n=3). **p<0.01, ***p<0.001 vs. Control; +++p<0.001 vs. Normal. Normal : non-TNF-α-induced HUVECs, Control : TNF-α-induced HUVECs.

6) MCP-1

세포 내 MCP-1 단백질 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 0.27±0.06, 대조군에서 1.00±0.07으로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 1.02±0.09, 0.65±0.08, 0.09±0.04로 나타나 PVC 200 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 5B).

7) ICAM-1

세포 내 ICAM-1 단백질 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 0.41±0.05, 대조군에서 1.00±0.07로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.62±0.06, 0.61±0.05, 0.35±0.02로 나타나 PVC 100 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 5C).

8) VCAM-1

세포 내 VCAM-1 단백질 발현량을 측정한 결과, 정상군에서 0.45±0.07, 대조군에서 1.00±0.09로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.69±0.05, 0.54±0.06, 0.52±0.08로 나타나 PVC 100 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 5D).

4. 세포 내 단백질 인산화

1) ERK

세포 내 ERK 단백질 인산화를 측정한 결과, 정상군에서 0.55±0.10, 대조군에서 1.00±0.15로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.94±0.11, 0.83±0.09, 0.72±0.08로 나타나 PVC 400 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 6A).

Fig. 6

Effects of PVC on ERK (A), JNK (B), and p38 (C) protein phosphorylation in HUVECs.

HUVECs were pretreated with PVC (100, 200, or 400 µg/mL) for 1 h, followed by stimulation with hTNF-α (10 ng/mL) for 24 h. Protein phosphorylation levels were measured by Western blot. Data are presented as mean±standard deviation (SD, n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. Control; ++p<0.01, +++p<0.001 vs. Normal. Normal : non-TNF-α-induced HUVECs, Control : TNF-α-induced HUVECs.

2) JNK

세포 내 JNK 단백질 인산화를 측정한 결과, 정상군에서 0.41±0.09, 대조군에서 1.00±0.07로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.72±0.05, 0.68±0.07, 0.61±0.06으로 나타나 PVC 100 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 6B).

3) p38

세포 내 p38 단백질 인산화를 측정한 결과, 정상군에서 0.32±0.01, 대조군에서 1.00±0.02로 나타났을 때, PVC 100, 200, 400 µg/mL의 농도에서 각각 0.91±0.07, 0.85±0.09, 0.79±0.07로 나타나 PVC 200 µg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 6C).

Ⅳ. 고 찰

심혈관 질환은 전 세계 사망원인 1위로 보고되었으며1,2, 국내 2023년 사망원인 통계에서도 심장질환과 뇌혈관질환이 각각 2위와 4위로 높은 순위를 차지하였다21. 특히, 심장질환 사망률은 2013년 대비 29.2%로 증가하였으며, 꾸준한 상승세를 보이고 있어, 심혈관 질환 예방과 치료에 대한 관심이 지속적으로 높아지고 있다21.

죽상경화증은 심혈관 질환을 유발하는 가장 중요한 병리 기전으로, 혈관 내피세포 손상에서 시작되는 염증 반응이 핵심적으로 작용한다3,6. 내피세포가 손상되면 혈관 투과성이 증가되어 LDL-C의 내막 침착 및 산화를 촉진하며, 이 과정에서 IL-6, TNF-α와 같은 염증성 cytokine 분비가 증가하고 ICAM-1, VCAM-1 등의 세포부착분자와 IL-8, MCP-1 등의 chemokine 발현이 활성화되어 단핵구의 내피 침윤이 가속화된다3,4. 유입된 단핵구는 대식세포로 분화한 후 산화된 LDL-C를 탐식하여 거품세포로 전환･축적되고 염증반응을 지속시키며, 중막의 평활근 세포의 내막 이동 및 증식을 유도하여 죽상판을 형성한다3,5. 이러한 병리적 진행은 혈류 장애와 혈전 형성을 초래하여 심근경색, 협심증, 뇌경색 등 치명적인 심혈관 질환으로 이어질 수 있다3-5.

죽상경화증의 치료는 주요 위험인자인 LDL-C 조절을 목표로 하며, statin 계열 약물이 1차 치료제로 사용되고 있다8. Statin은 HMG-CoA 환원효소를 경쟁적으로 억제하여 콜레스테롤 합성의 속도 조절 단계를 차단함으로써 총콜레스테롤 및 혈장 LDL-C 농도를 효과적으로 감소시키지만, 두통, 소화장애, 복통, 속쓰림, 불면증 등의 부작용이 보고되었으며, 드물게는 횡문근 융해 및 간 손상이 발생하기도 한다3,8. 또한 ezetimibe, cholestyramine, niacin 등 다른 항고지혈증 약물 역시 복통, 설사, 오심, 홍조 등의 부작용이 보고되었다8,9. 이러한 기존 약물치료의 한계와 이상지질혈증 유병률의 증가는 보다 안전하고 효과적인 천연물 기반 예방 및 치료 소재에 대한 연구의 필요성을 시사한다7,8.

枳實은 운향과(芸香科: Rutaceae)에 속한 常綠小喬木인 탱자나무(Poncirus trifoliata Rafinesque)의 幼果로, 전통적으로 積滯內停, 痞滿脹痛, 瀉痢後重, 大便不通, 痰滯氣阻結痺, 結胸 등의 치료에 활용되어 왔다10. 현대 약리 연구에서는 Zhou 등13은 枳實에서 분리한 21(α, β)-methylmelianodiols의 항염 활성 실험에서 LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포에서 NO의 생성 및 염증성 cytokine을 억제함을 확인하였고, 함 등16은 Triton WR-1339 유발 고지혈증 흰쥐 모델에서 枳實이 TG(triglyceride)와 혈청 콜레스테롤을 유의하게 감소시켜 Simvastatin과 유사하게 항고지혈 효과가 있음을 보고하였다.

紫花地丁은 제비꽃과(堇菜科: Violaceae)에 속한 多年生草本인 제비꽃(Viola mandshurica Baker) 및 동속 근연식물의 帶根全草로, 전통적으로 疔瘡腫毒, 癰疽發背, 毒蛇咬傷, 丹毒 등에 활용되어 왔다10. 약리적으로 한18은 紫花地丁이 LPS 유도 RAW 264.7 대식세포를 이용한 실험연구에서 NO 생성 및 염증성 cytokine을 억제함을 보고하였고, 박 등20은 고지방 식이 마우스 모델에서 紫花地丁 투여가 체중 및 혈청 지질 감소, 세포부착분자 및 지방산 합성효소 등 발현 억제를 통해 죽상경화증 억제 효과를 나타낸다고 보고하였다.

이러한 전통적 기록10,11,17과 현대적 연구 결과12-16,18-20를 종합하면, 枳實은 주로 지질대사 개선 및 항염증 조절, 紫花地丁은 염증 반응 억제 및 내피세포 활성 조절에 강점을 가진 약재임을 알 수 있다. 따라서 두 약재를 복합할 경우, 죽상경화 진행의 주요 기전인 지질대사 이상과 염증 반응을 동시에 조절할 수 있는 상호보완적 효과를 기대할 수 있다. 특히, 죽상경화증은 내피세포 손상과 만성 염증이 병행되는 복합적 질환 기전으로 알려져 있으며3,4,6, 두 약재의 병용은 단일 약재 사용보다 다중 기전접근을 가능하게 하여 부가적 또는 시너지 효과를 발휘할 것으로 기대되나, 현재까지 枳實과 紫花地丁 복합제(Poncirus trifoliata Rafinesque and Viola mandshurica Baker Complex, PVC)를 활용한 연구는 보고된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 PVC의 항염증 효능을 검증하여 죽상경화증의 주요 병리 기전인 내피 손상 억제 가능성을 확인하고, 이를 통해 심혈관 질환 예방 및 치료약물로서의 활용 가능성을 탐색하고자 하였다.

본 연구에 앞서 PVC의 안정성을 확인하기 위해 PVC의 HUVEC에 대한 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 400 µg/mL 이하의 농도에서는 HUVEC에 대한 세포 독성이 나타나지 않았으나, 600 µg/mL 이상의 농도에서는 90% 이하의 세포 생존율을 보였다(Fig. 1). 이를 토대로, 이후 연구에서는 PVC의 농도를 100 µg/mL부터 400 µg/mL까지만 설정하여 실험을 진행하였다.

본 연구는 분석에 사용할 HUVEC에 100, 200, 400 µg/mL의 농도로 PVC를 처리한 후 10 ng/mL의 TNF-α를 추가하여 염증 반응을 유도한 뒤 다시 24시간 동안 배양 후 수집한 세포에서 혈관 염증 관련 지표의 유전자 및 단백질 발현량을 평가함으로써 혈관내피에서 항염증 효과 및 그 기전을 알아보고자 하였다.

IL-6(Interleukin-6)는 대식세포에서 생성되는 대표적 염증성 cytokine으로 급성 염증의 핵심 매개 인자이며6,22, MCP-1의 발현을 자극하고, 혈소판 응집, 평활근 세포의 증식을 촉진하며, 죽상판의 불안정성과 상관관계가 있다고 알려져 있다6,23.

NO(Nitric Oxide)는 혈관 항상성 유지에 필수적인 조절인자로, iNOS(inducible NOS)에 의해 염증 반응에서 생성된 과량의 NO는 산화 스트레스와 세포 독성을 유발하는 반면, eNOS(endothelial NOS)는 생리적 수준의 NO를 생성하여 혈관 이완, 혈소판 응고 억제, 백혈구의 활성 및 부착 감소, LDL-C의 산화 억제 등을 통해 내피세포 기능을 유지하고 죽상경화를 억제하는 것으로 알려져 있다5,24. 이와 같이 NO 생성의 불균형은 내피세포 기능 장애와 죽상경화의 진행에 중요한 역할을 하며, 심혈관 질환의 병태생리에서 핵심 기전으로 작용한다4. 특히, NO의 양면적 작용은 iNOS와 eNOS의 상반된 조절 기전에서 기인하며, NO의 균형 회복이 심혈관 질환의 예방 및 치료를 위한 중요한 전략으로 제시되고 있다24.

KLF2(Krüppel-Like Factor 2)는 내피세포에서 VCAM-1, E-selectin과 같은 염증성 세포부착분자의 발현을 억제하고, eNOS 발현을 상향 조절하는 항염증 전사인자로 알려져 있으며, Statin 제제가 KLF2의 발현을 조절하여 염증 반응을 감소시킨다고 보고된 바가 있다25,26.

본 연구에서 PVC 처리군은 IL-6과 iNOS 발현을 농도 의존적으로 억제하고, 반대로 eNOS와 KLF2 발현을 증가시켰다(Fig. 2, 4). IL-6 억제는 염증 반응과 죽상판 불안정성을 완화하는 기전과 연결될 가능성이 있으며6,22,23, KLF2 증가는 eNOS 발현을 상향 조절하고 염증성 세포부착분자를 억제하는 항염증 경로와 관련될 수 있다25. 또한, NO의 양면적 역할에 대한 기존 보고26와도 맥락을 같이하며, PVC가 iNOS 매개 과량 NO 생성을 억제하고 eNOS 매개 생리적 NO 생성을 촉진함으로써 내피세포 염증 반응을 억제하고 혈관 보호 효과를 발휘할 가능성을 시사한다.

Chemokine은 염증 반응에서 백혈구의 화학주성을 유도하고 활성화를 매개하는 단백질로, 대표적으로 CXC와 CC 계열이 죽상경화 병태생리와 밀접하게 연관되어 있다3-5. IL-8(Interleukin-8)은 CXC 계열에 속하며, 호중구의 화학주성과 활성화를 촉진하여 내피세포 손상과 혈전 형성을 심화시키는 것으로 알려져 있다3,5. MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1)은 CC 계열에 속하며, 단핵구 모집과 활성화를 유도해 내피 염증을 가속화하고 죽상경화의 진행을 촉진한다5,27. 또한 Chemokine은 혈관 내막에서 세포부착분자(Cell Adhesion Molecule, CAM)의 발현을 유도하여 내피세포 활성화를 촉진한다4,27.

대표적인 CAM인 ICAM-1(Intercellular Adhesion Molecule-1)과 VCAM-1(Vascular Cell Adhesion Molecule-1)은 염증 자극 하에서 발현이 증가하여 단핵구의 내피 부착과 침윤을 촉진하고, 이 과정에서 대식세포로 분화한 단핵구가 산화 LDL-C를 흡수하여 거품세포를 형성함으로써 죽상경화 병변의 성장을 가속화한다28.

본 연구에서 PVC는 IL-8 발현에는 유의한 변화를 보이지 않았으나(Fig. 3A, 5A), MCP-1, ICAM-1, VCAM-1 발현은 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 3B-D, 5B-D). 이러한 결과는 PVC가 특정 Chemokine에는 선택적으로 작용하면서도 Chemokine-CAM 경로 전반을 억제하여 내피세포 염증 반응과 죽상경화 진행을 완화할 수 있음을 시사한다.

MAPKs(Mitogen-Activated Protein Kinases) 경로는 세포 내외 자극에 반응하여 전사인자를 인산화하고 염증 반응을 조절하는 신호전달 체계로, 대표적으로 MAPKs인 ERK(Extracellular Signal Regulated Kinase), JNK(c-Jun N-terminal Kinase), p38 MAP kinase가 있다29. 이들은 NF-κB 활성화를 매개하여 IL-6, TNF-α, MCP-1 발현을 증가시키며, 내피세포 활성화와 염증 반응의 진행에 기여한다4,29. 따라서 MAPKs의 과활성은 염증 반응을 증폭시키고, 이들의 인산화 억제는 항염증 효과와 관련될 수 있다. 본 연구에서 PVC는 ERK, JNK, p38의 인산화를 농도 의존적으로 유의하게 억제하였으며(Fig. 6), 이는 PVC가 MAPKs 경로 차단을 통해 NF-κB 매개 염증 반응을 억제할 수 있음을 나타낸다29.

이상의 결과를 종합하면, PVC는 혈관 내피세포에서 염증 매개인자인 cytokine, chemokine 및 세포부착분자의 발현을 유의하게 억제하고, 항염증 조절 인자의 발현을 증가시키며, MAPKs 신호전달 경로를 억제함으로써 내피세포 손상을 완화하고 항염증 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 본 연구는 혈관 염증 반응이 주요 기전으로 작용하는 죽상경화 등 심혈관 질환의 예방 및 치료를 위한 유효 물질 개발에 기초적 근거를 제공할 수 있을 것으로 판단된다. 다만, 본 연구는 세포 수준의 in vitro 실험에 국한되었고, 양성 대조군을 포함하지 않아 PVC의 항염증 효과가 기존 약제 대비 비교우위를 갖는지 확인하기 어렵다는 한계가 있다. 향후, 양성 대조군을 포함한 후속 연구와 동물 모델을 이용한 in vivo 연구를 통해 PVC의 심혈관 질환, 특히 죽상경화 예방 및 치료 효과를 보다 명확히 규명할 필요가 있다.

Ⅴ. 결 론

枳實과 紫花地丁 복합제(PVC)를 전처리한 후 TNF-α로 염증 유도한 HUVEC에서의 항염증 효과를 평가한 결과, 다음과 같은 결론을 도출하였다.

1. PVC는 IL-6, iNOS의 유전자 및 단백질 발현량을 대조군에 비해 유의하게 감소시켰다.

2. PVC는 KLF2, eNOS의 유전자 및 단백질 발현량을 대조군에 비해 유의하게 증가시켰다.

3. PVC는 IL-8의 유전자 및 단백질 발현량에는 유의한 변화를 보이지 않았으나, MCP-1, ICAM-1, VCAM-1의 유전자와 단백질 발현은 대조군에 비해 유의하게 감소시켰다.

4. PVC는 ERK, JNK, p38 단백질 인산화를 대조군에 비해 유의하게 감소시켰다.

이상의 결과는 PVC가 혈관 내피세포의 염증 반응을 억제하고 내피 보호 효과를 나타낼 수 있음을 보여주며, 죽상경화 등 심혈관 질환 예방 및 치료를 위한 유효 물질로 활용될 가능성을 시사한다. 다만 본 연구는 in vitro 수준에 국한되었으므로, 향후 동물 실험 및 임상 연구를 통해 유효성과 안전성을 검증할 필요가 있다.

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Gene name	Size (bp)	F/R*	Sequences
IL-6	114	F	TTTGAGAGTAGTGAGGAACAA

		R	GGTTGGGTCAGGGGTGGTTATT

iNOS	81	F	AGGTCCAAATCTTGCCTGGG

		R	ATCTGGAGGGGTAGGCTTGT

eNOS	152	F	CTCATGGGCACGGTGATG

		R	ACCACGTCATACTCATCCATACAC

KLF2	100	F	CCTCCTTGACGAGTTTTGTTTTTC

		R	AAGGCATCACAAGCCTCGAT

IL-8	116	F	CACTGCGCCAACACAGAAAT

		R	TTCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTC

MCP-1	150	F	GCTCAGCCAGATGCAATCAA

		R	CTTGGCCACAATGGTCTTGA

ICAM-1	152	F	TCTTCCTCGGCCTTCCCATA

		R	AGGTACCATGGCCCCAAATG

VCAM-1	127	F	CCCTACCATTGAAGATACTGG

		R	ATCTCTGGGGGCAACATTGAC

β-actin	103	F	CATTCCAAATATGAGATGCGTTGT

		R	TGTGGACTTGGGAGAGGACT

Herbal medicine name	Scientific name	Origin	Weight (g)
枳實	Poncirus trifoliata Rafinesque	Korea	20
紫花地丁	Viola mandshurica Baker	Korea	20

Total amount			40