Ⅰ. 서 론
염증(inflammation)은 조직의 손상이나 병원균의 침입 및 외부 자극으로부터 우리 몸을 보호하기 위한 필수적인 생체 내 면역반응이다1. 염증의 다양한 원인 중에서, lipopolysaccharide(LPS)는 내독소 역할을 하며 인체 내에서 강한 면역 반응을 이끌어낸다. 또한, LPS는 대식세포에서 가장 강력한 염증 활성화제로 작용하며, 다양한 전염증성 매개체들을 발현시킨다2. 정상적인 염증 반응은 항상성 유지와 조직 복구에 기여하지만, 과도한 면역 활성은 다양한 병리적 상태를 초래하여 염증성 질환을 유발할 수 있다3. 따라서 활성화된 염증 반응을 조절하고 염증 매개체의 생성을 억제하는 것은 제반 염증성 질환의 예방과 치료에 있어 매우 중요하다.
산화 스트레스는 주로 생체 내에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의해 유도되어 과도한 산화 반응을 일으키고, ROS의 과도한 축적은 피부의 화학적 및 형태학적 변화를 초래하여 염증 반응을 촉진시킨다. 이처럼 산화 스트레스와 염증 반응은 상호 연관되어 다양한 조직 손상 및 질병을 유발하며, 산화 스트레스를 감소시키는 항산화 작용은 염증 반응을 조절하는데 도움을 주므로 항산화 물질의 개발 또한 염증성 질환을 치료하는데 있어 중요한 과제이다4.
통증, 발열 및 염증에 대한 치료제로 흔히 사용되는 합성 비스테로이드 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)는 다양한 염증성 질환에 활용되며 그 효과가 뛰어나나, 위장관 출혈, 신기능 저하, 심부전 등의 위장관계, 신장, 심혈관계 부작용 및 합병증이 발생한다고 알려져 있다5. 따라서 부작용이 적고 안정성이 확보된 천연물 유래 항염증제 개발을 위한 연구가 지속되고 있으며, 특히 유6는 총 198편의 실험 논문을 분석하여 항염증 효과가 보고된 단일 약재, 복합 제제 및 한약 처방을 정리하였는데, 단일 약재로는 人蔘, 豆豉, 竹葉, 金銀花, 梔子, 知母, 山茱萸, 五味子 등 주로 淸熱藥, 補益藥, 收澁藥 계열의 약재가 사용되었고, 복합 제제에서는 黃蓮과 甘草의 활용 빈도가 높았으며, 한약 처방으로는 加味逍遙散, 當歸鬚散, 烏梅丸 등이 사용된 것으로 나타났다.
三仁湯은 ≪東醫寶鑑･雜病篇≫7에 수록된 처방으로, 薏苡仁, 冬瓜子, 桃仁, 牧丹皮로 구성되어 있으며 腸癰을 치료한다. 腸癰은 癰의 하위분류 중 內癰에 속하며, 氣血이 통하지 않아 皮肉에 발생하는 급성 화농성질환의 하나로서, 그 특징은 국부의 발적, 발열, 동통, 종창이다. 이는 현대의학의 염증의 개념과 일치되는 증상으로 三仁湯이 염증성 질환에 효과가 있을 것으로 사료되었으나8, 三仁湯을 구성하는 薏苡仁, 冬瓜子, 桃仁, 牧丹皮 각각의 개별 약재에 대한 항산화 효능 및 항염증 효과에 대해서는 다양한 연구9-16가 보고되어 있는 반면, 三仁湯 자체의 항산화 활성 및 염증 반응 개선 효과에 대한 연구는 아직까지 보고되지 않았다.
이에 三仁湯의 항산화 효능 및 항염증 기전을 규명하고자 본 연구를 시행하였다. 항산화 효능을 평가하기 위해 총 polyphenol 및 flavonoid 함량을 측정하였고, DPPH, ABTS radical 소거능을 확인하였다. 또한, 항염증 효과를 평가하기 위해 RAW 264.7 대식세포를 이용하여 NO, PGE2, Cytokine의 생성량과 염증 억제 기전 관련 인자들의 유전자, 단백질 발현량 및 인산화를 측정하였으며 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 재 료
2) 시 약
본 실험에는 gallic acid(Sigma, U.S.A.), quercetin (Sigma, U.S.A.), sodium carbonate(Sigma, U.S.A.), aluminium nitrate nonahydrate(Sigma, U.S.A.), potassium acetate solution(Sigma, U.S.A.), 1,1 -diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH)(Sigma, U.S.A.), 2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)(Sigma, U.S.A.), penicillin-streptomycin (Sigma, U.S.A.), trypan blue(Sigma, U.S.A.), lipopolysaccharides(Sigma, U.S.A.), protease inhibitor cocktail(Sigma, U.S.A.), phosphatase inhibitor cocktail (Sigma, U.S.A.), folin-ciocalteu’s phenol reagent(Merck, Germany), ethanol(Merck, Germany), methanol(Merck, Germany), EZ-cytox(DoGenBio, Korea), Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM)(Gibco, U.S.A.), fetal bovine serum(FBS)(Gibco, U.S.A.), nitric Oxide plus detection kit(iNtRON Biotechnology, Korea), total RNA extraction kit, acrylamide-Bis Solution 30%(iNtRON Biotechnology, Korea), 1.5 M Tris-HCl(pH 8.8)(iNtRON Biotechnology, Korea), 0.5M Tris-HCl(pH 6.8)(iNtRON Biotechnology, Korea), 10X Tris-Glycine-SDS buffer(iNtRON Biotechnology, Korea), 10X transfer Buffer(iNtRON Biotechnology, Korea), 10X TBS with Tween 20(iNtRON Biotechnology, Korea), prostaglandin E2 Parameter Assay Kit(R&D Systems, U.S.A), mouse IL-1 beta ELISA kit(Komabiotech, Korea), mouse IL-6 ELISA kit(Komabiotech, Korea), mouse TNF-alpha ELISA kit(Komabiotech, Korea), RIPA lysis and extraction buffer(Thermo Fisher Scientific, U.S.A) Pierce™ BCA protein assay Kit(Thermo Fisher Scientific, U.S.A), 10% ammonium persulfate (Thermo Fisher Scientific, U.S.A) 등을 사용하였다.
3) 기 기
본 실험에는 extraction mantle(Misung Scientific, Korea), rotary vacuum evaporator(EYELA, Japan), freeze dryer(ilShinbiobase, Korea), CO2 incubator (Sanyo, Japan), autoclave(Sanyo, Japan), deep-freezer (Sanyo, Japan), clean bench(Vision scientific, Korea), vortex mixer(Vision scientific, Korea), centrifuge (Vision scientific, Korea), ice-maker(Vision scientific, Korea), plate shaker(Lab-Line, U.S.A.), micro plate reader(Molecular Devices, U.S.A.), nanodrop(Thermo Fisher Scientific, U.S.A.), PCR cycler(PCRmax, U.K.), real-time PCR cycler(Bioneer, Korea), chemidoc(Vilber Lourmat, France) 등의 장비를 사용하였다.
2. 방 법
1) 시료 추출
2첩 분량의 SIT(76 g)에 1 L의 증류수를 넣어 100 ℃에서 3시간 동안 추출하였으며, 여과지를 사용하여 추출물을 여과하였다. 여과된 추출물은 rotary vacuum evaporator를 통해 감압 농축하고 freeze dryer를 통해 동결건조를 진행하였다. 동결건조 완료 후, 11.49 g(수득률: 15.12%)의 분말을 얻어 -20 ℃에 보관하였으며, 실험 당일 소분하고 증류수에 용해하여 사용하였다.
2) 실험군 분류
RAW 264.7 세포에 LPS와 SIT를 처리하지 않은 군을 정상군(Normal), 500 ng/mL의 LPS를 처리하여 염증 반응을 유도한 군을 대조군(Control)으로 설정하였다. 또한 SIT 투여군(50, 100, 200)은 500 ng/mL의 LPS를 처리하여 염증 반응을 유도하고 각각 50, 100, 200 μg/mL 농도의 SIT를 투여한 군으로 분류하여 진행하였다.
3) 항산화 효능 평가
(1) 총 polyphenol 함량 측정
SIT를 1 mg/mL 농도로 준비하였으며, 시료 1 mL에 50% folin-ciocalteu’s phenol reagent 0.5 mL를 가하여 실온에서 3분간 반응시켰다. 반응용액에 Na2CO3 포화용액 1 mL와 7.5 mL 증류수를 차례로 혼합하여 30분간 정치시킨 뒤, 14,000 g에서 10분간 원심 분리분리한 후 상등액을 취해 760 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 polyphenol 함량은 gallic acid를 표준물질로 이용하여 작성한 검량선에 따라 함량을 구하였다.
(2) 총 flavonoid 함량 측정
SIT를 1 mg/mL 농도로 준비하였으며, 시료 0.1 mL과 80% 에탄올 0.9 mL을 혼합한 혼합물 0.5 mL에 10% aluminium nitrate와 1 M potassium acetate 0.1 mL 그리고 80% 에탄올 4.3 mL을 가하여 실온에 40분 방치한 뒤 415 nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, quercetin을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
(3) DPPH radical 소거능 측정
SIT의 최종 농도가 1, 10, 100, 1000 μg/mL의 농도로 될 수 있게 희석시켰으며, 에탄올에 용해시킨 0.2 mM의 DPPH 용액 150 μL와 시료를 100 μL씩 혼합하여 37 ℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 대조군은 증류수를 넣었으며, DPPH 용액의 대조군으로써는 에탄올을 넣어 보정값을 얻었다.
(4) ABTS radical 소거능 측정
SIT의 최종 농도가 1, 10, 100, 1000 μg/mL의 농도로 될 수 있게 희석시켰으며, ABTS 용액은 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 제조한 후, 암소에 하루 동안 방치하여 양이온(ABTS·+)을 형성시킨 다음 732 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 1.5 이하가 나오도록 희석하고, 희석된 ABTS·+용액 150 μL와 시료를 5 μL씩 혼합하고, 실온에서 10분간 반응시킨 후, 732 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
4) 세포 배양
생쥐 유래 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank; KCLB)에서 구입하여 사용하였으며, 10%의 FBS가 추가된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2 조건이 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 세포의 계대 배양은 2-3일 주기로 진행하였다.
5) 세포 생존율 측정
RAW 264.7 세포를 48 well plate에 2×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하고 SIT를 50, 100, 200, 400 μg/mL의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후 배양액 100 μL당 10 μL의 EZ-Cytox 용액을 첨가하여 세포배양기에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 micro plate reader기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
6) Nitric oxide(NO) 생성량 측정
RAW 264.7 세포는 48 well plate에 2×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하고 500 ng/mL의 LPS를 처리하고 SIT를 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 추가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후 N1 buffer 100 μL를 추가하여 상온에서 10분간 반응시켰으며, 반응 후 N2 buffer 100 μL를 추가하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응 후, micro plate reader기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
7) Prostaglandin E2(PGE2) 생성량 측정
RAW 264.7 세포는 48 well plate에 2×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하고 500 ng/mL의 LPS를 처리하고 SIT를 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 추가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후 primary antibody 50 μL를 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 conjugate를 50 μL씩 추가하여 상온에서 2시간 반응시켰다. plate에 있는 시약은 버리고 washing buffer를 넣어서 3회 세척하였다. 세척 후 substrate solution을 200 μL씩 추가하여 상온에서 30분 반응시켰다. 반응 후 stop solution을 100 μL씩 추가하여 micro plate reader기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, standard curve를 기준으로 절댓값으로 나타내었다.
8) Cytokine 생성량 측정
RAW 264.7 세포를 6 well plate에 1×105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하고 500 ng/mL의 LPS를 처리하고 SIT를 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 추가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후, ELISA kit를 사용하여 96 well plate에 분리한 세포 배양액 100 μL를 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 plate에 있는 시약은 버리고 washing buffer를 넣어 4회 세척하였다. 세척 후 detection antibody를 100 μL씩 추가하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 plate에 streptavidin-HRP 100 μL씩 추가하여 상온에서 30분 반응시켰다. 반응 후 TMB or pink-ONE solution 100 μL씩 각 well에 넣은 후 15분간 반응시키고 100 μL의 stop solution을 추가하여 micro plate reader기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, standard curve를 기준으로 절댓값으로 나타내었다.
9) 유전자 발현량 측정
RAW 264.7 세포를 6 well plate에 1×105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하고 500 ng/mL의 LPS를 처리하고 SIT를 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 추가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후, 원심 분리하여 얻은 세포와 total RNA prep kit를 사용하여 RNA를 추출하였으며, 추출한 RNA는 reverse transcription premix와 혼합하고 PCR cycler를 사용하여 45 ℃에서 60분, 95 ℃에서 5분간 반응을 통해 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 특정 유전자를 증폭시켜 확인하기 위해 real-time PCR을 진행하였으며, cDNA와 특정 유전자에 맞는 primer, SYBR green premix를 혼합하여 95 ℃에서 2분 동안 반응시키고 95 ℃에서 5초, 62.5 ℃에서 30초를 40회 반복하여 특정 유전자를 증폭시켰다. 유전자 발현량은 대조군의 유전자 발현량을 기준으로 상대 정량하였으며, 사용된 primer들의 정보는 다음과 같다(Table 2).
Table 2
Real-Time PCR Primer Sequences
10) 단백질 발현량 측정
RAW 264.7 세포를 6 well plate에 1×105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하고 500 ng/mL의 LPS를 처리하고 SIT를 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 추가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 모든 배양이 종료된 후, 원심 분리하여 얻은 세포는 protease inhibitor cocktail Ⅰ, phosphatase inhibitor Ⅱ, Ⅲ가 포함된 RIPA buffer를 넣어 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 BCA protein assay kit를 이용하여 정량하였으며, sample loading buffer와 섞어 95 ℃에서 5분간 반응시켜 준비하였다. 준비된 단백질은 10% acrylamide gel을 통해 SDS-PAGE하여 크기별로 분리하였으며, PVDF membrane에 이동시켰다. 단백질이 옮겨진 membrane을 3% BSA에 담가 상온에서 2시간동안 반응시켰다. TBS-T buffer를 이용하여 세척하고 primary antibody를 넣어 4 ℃에서 16시간동안 반응시켰다. 다시 3회 세척하고 secondary antibody를 넣어 상온에서 1시간동안 반응시켰으며, 다시 세척하고 ECL solution을 통해 단백질을 발색시켰다. 이후, chemidoc fusion FX를 통해 단백질 발현량을 분석하였다.
Ⅲ. 결 과
1. 항산화 효능
Gallic acid를 표준물질로 하여 SIT에 존재하는 총 polyphenol 함량을 측정한 결과, 20.52±0.14 mg GAE/g 으로 나타났으며, Quercetin을 표준물질로 하여 SIT에 존재하는 총 flavonoid 함량을 측정한 결과, 5.93±0.51 mg QE/g 으로 나타났다(Table 3). 또한, DPPH radical 소거능과 ABTS radical 소거능을 측정한 결과, SIT에 대한 농도 의존적인 소거능의 증가가 나타났다(Fig. 1).
Table 3
Total Polyphenol and Total Flavonoid Contents of SIT
| Total polyphenol (mg GAE*)/g) | Total flavonoid (mg QE**)/g) |
|---|---|
| 20.52±0.14 | 5.93±0.51 |
Fig. 1
DPPH and ABTS radical scavenging activity of SIT.
SIT were incubated at 1, 10, 100, and 1000 μg/mL with DPPH solution for 30 min. The measurement of absorbance at 517 nm was completed to determine the activities. SIT were incubated at 1, 10, 100, and 1000 μg/mL with ABTS solution for 10 min. The measurement of absorbance at 732 nm was completed to determine the activities. The results were expressed as mean±standard deviation of mean from three independent experiments.
2. 세포 생존율
SIT는 50 μg/mL 이상의 농도에서 세포증식이 나타났으며, 400 μg/mL 이상의 농도에서는 90% 이하의 세포 생존율을 보여 본 실험에서는 200 μg/mL 농도까지 진행하였다(Table 4).
3. 항염증 효능
1) NO 생성량
NO 생성량을 측정한 결과, SIT 투여군은 100 μg/mL 이상의 농도에서 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다(Fig. 2).
Fig. 2
Effect of SIT on NO, PGE2, IL-1β, IL-6, TNF-α level in RAW 264.7 cells.
RAW 264.7 cells were treated 50, 100, 200 μg/mL of SIT with 500 ng/mL LPS for 24 h. NO level were calculated as percentage relative to the control. Treated cells were measured by mouse PGE2, IL-1β, IL-6, TNF-α ELISA kit. The results of the three independent experiments were described as mean±standard deviation. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey’s HSD post-hoc test (p<0.05). Groups not sharing the same letter are significantly different, whereas groups with the same letter do not differ significantly. Normal : RAW 264.7 cells without treatment of LPS or SIT, Control : RAW 264.7 cells stimulated with LPS without SIT treatment, 50, 100, 200 : RAW 264.7 cells treated with LPS and SIT (50, 100, 200 μg/mL).
3) Cytokine 생성량
Cytokine 생성량을 측정한 결과, SIT 투여군의 IL-1β, IL-6 생성량은 100 μg/mL 이상의 농도에서, TNF-α 생성량은 200 μg/mL 농도에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 2).
4) 유전자 발현량
유전자 발현량을 측정한 결과, SIT 투여군의 IL-6 발현량은 50 μg/mL 이상의 농도에서, iNOS, COX-2 발현량은 100 μg/mL 이상의 농도에서, IL-1β, TNF-α 발현량은 200 μg/mL 농도에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 3).
Fig. 3
Effect of SIT on iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α mRNA expression level in RAW 264.7 cells.
RAW 264.7 cells were treated 50, 100, and 200 μg/mL of SIT with 500 ng/mL LPS for 24 h. iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α mRNA expression level were measured by polymerase chain reaction. The results of the three independent experiments were described as mean±standard deviation. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey’s HSD post-hoc test (p<0.05). Groups not sharing the same letter are significantly different, whereas groups with the same letter do not differ significantly. Normal : RAW 264.7 cells without treatment of LPS or SIT, Control : RAW 264.7 cells stimulated with LPS without SIT treatment, 50, 100, 200 : RAW 264.7 cells treated with LPS and SIT (50, 100, 200 μg/mL).
5) 단백질 발현량
단백질 발현량을 측정한 결과, SIT 투여군의 COX-2, IL-1β, IL-6 발현량은 50 μg/mL 이상의 농도에서, iNOS 발현량은 100 μg/mL 이상의 농도에서, TNF-α 발현량은 200 μg/mL 농도에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 4).
Fig. 4
Effect of SIT on iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6, TNF-α protein expression level in RAW 264.7 cells.
RAW 264.7 cells were treated 50, 100, and 200 μg/mL of SIT with 500 ng/mL LPS for 24 h. The total cell extracts were subjected to 10% SDS-PAGE and western blot analysis with the respective primary and secondary antibodies. The result were presented by the mean±S.D from three independent experiments. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey’s HSD post-hoc test (p<0.05). Groups not sharing the same letter are significantly different, whereas groups with the same letter do not differ significantly. Normal : RAW 264.7 cells without treatment of LPS or SIT, Control : RAW 264.7 cells stimulated with LPS without SIT treatment, 50, 100, 200 : RAW 264.7 cells treated with LPS and SIT (50, 100, 200 μg/mL).