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The Journal of Internal Korean Medicine > Volume 43(1); 2022 > Article
진달래 뿌리 추출물의 알레르기 염증 억제 효과

Abstract

Objective:

In this study, we investigated the protective effect of rhododendron mucronulatum extract (RME) on allergic reactions and inflammation.

Methods:

The effect of RME was determined using ELISA and RT-PCR in RBL-2H3 mast cells and RAW 264.7 macrophage cells. We determined cell viability, β-hexosaminidase release, and the synthesis of IL-4 and TNF-α in RBL-2H3 cells. In addition, we determined NO from RAW 264.7 and the gene expression of IL-1β, iNOS, IL-6, TNF-α, and IL-10.

Results:

RME inhibited β-hexosaminidase release and synthesis of IL-4 and TNF-α in RBL-2H3 by the anti-DNP IgE plus DNP-HSA stimulation. In addition, RME inhibited the production of NO and the gene expression of IL-1β, iNOS, IL-6, and TNF-α in LPS-stimulated RAW 264.7 cells.

Conclusion:

From these results, we concluded that RME possesses anti-allergic activity and anti-inflammatory activity due to the inhibition of mast cells and macrophage function.

Ⅰ. 서 론

알레르기 질환은 mast cell, neutrophil, basophil, eosinophil 등 다양한 면역세포가 관여한다1. 그 중 비만세포에서 histamine, tryptase, TNF-α 등의 염증 매개물질이 분비되며2,3, interleukin-4, IL-9, IL-13 등의 사이토카인, ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 등의 활성화 인자4, MCP-3와 RANTES 등의 케모카인 물질5, leukotrienes과 PAF 등의 생성물이 복합적으로 작용하여 염증을 유발시킨다6. 또한 대식세포는 IL-1, IL-6, TNF-α 등을 분비하며7, 다른 염증 관여 세포들에서 phospholipase C의 활성화를 통한 분비 기능과 단백질 생합성의 촉진9, 또는 phospholipase A2 활성화를 통한 prostaglandin류와 leukotriene류 생합성과 혈액 응고 인자의 활성화를 통해 염증을 유발한다10. 이와는 별도로 대식세포는 면역 항체와 보체의 도움으로 병원체를 탐식한 후 RNS, ROS와 가수분해 효소, 단백분해 효소 등의 작용을 통해 탐식된 병원체를 분해한다11.
진달래(Rhododendron mucronulatum)는 우리나라를 비롯하여 중국 일본 등에서 자생하는 진달래과(Ericaceae) 식물로 높이가 2 m 정도인 낙엽 관목의 꽃나무이다12. 진달래 꽃은 한의학에서는 杜鵑花라 하며 酸, 平하며 化痰止咳, 活血止血, 祛風濕하는 작용이 있어, 두통, 해수, 기관지염, 월경부조, 관절통 등에 사용되었다. 특히 꽃에 대한 약리효능으로 항산화효과, 항암효과가 보고되었으며, flavonoid 성분인 myricetin에 대한 항염 효능과13, taxifolin, myristin, quercetin 3-O-α-L-arabinofuranoside, epicatechin 등 성분이 COX-2 활성을 억제하는 보고가 있다14.
최근 민간에서는 진달래의 뿌리가 알레르기에 효과가 있다고 알려져 있으며, 이에 본 연구진은 뿌리 추출물(杜鵑花根추출물, RME)의 항염증효과를 평가하고자 하였다. 먼저 세포독성을 분석하고, 비만세포로부터 알레르기 지표물질인 β-hexosaminidase 생성과 유리, IL-4, TNF-α 생성에 미치는 영향을 측정하였으며, 또한 대식세포로부터 염증물질인 NO 생성과, IL-1β, iNOS, IL-6, TNFα, IL-10 등 염증관련 사이토카인 발현에 미치는 영향을 측정하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 방 법

1. 시약 및 기기

1) 진달래 뿌리 추출물 제조

본 실험에서 사용한 진달래(Rhododendron mucronulatum)는 강원 홍천군 가리산에서 5월에 채취하였다. 진달래 뿌리를 건조시킨 후 분쇄한 다음 30% 에탄올 용액을 중량 대비 40배를 넣고 80도에서 4시간 환류 추출하고 감압 농축하여 동결 건조하여 RME를 얻었으며, 수율은 약 6.7%이었다. 실험에는 RME를 dimethyl sulfoxide에 100 mg/mL 농도로 용해하여 사용하였으며, 세포에 처리 시 최종 DMSO 농도가 0.5%(v/v) 이하가 되도록 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) 배지에 희석하여 실험에 사용하였다.

2) 시약 및 장비

1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) (Rockford, IL, USA)에서, 우태아 혈청(FBS), penicillin, 100 units/mL streptomycin, 100 μg/mL DMEM, Trypsin-EDTA는 Gibco(Waltham, MA, USA)에서, Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline는 WELGENE(경북, 한국, Korea), EZ-CYTOX (Cell Viability, & Cytotoxicity Assay kit)는 DoGenbio (한국)에서, siraganian buffer(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 25 mM PIPES(110 mM NaCl, 4 mM KCl, 0.4 mM MgCl, 40 mM HCl, 5.6 mM glucose, 1 mM CaCl2, and 0.1% BSA 25 mM PIPES, pH 7.2), 40 mM NaOH, pH7.2)는Bioneer에서 구입하였고, microplate reader는 EMax (molecular devices, San Tose, CA, USA)를 이용하였다.

2. 실험 방법

1) 항산화능 및 Raw 264.7 세포에 대한 항염증 영향 측정

(1) RME 항산화능 측정
RME의 항산화효과는 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)에 시약을 이용하여 측정하였다. 농도별로(3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL) 100 μL와 DPPH용액 60 μM 100 μL를 96-well plate에 넣고 혼합하여 실온의 암실에서 30분간 방치한 후, EMax를 사용하여 550 nm에서 최대 흡광도를 측정하였다. 항산화 효과는 시료첨가군과 비첨가군의 흡광도 차이를 백분율(%)로 구하였다.
(2) Raw 264.7 대식세포 배양
염증에 미치는 영향을 평가하기 위해 대식세포 RAW 264.7 cell을 사용하였다. DMEM(10% FBS /PC-SM)배지에 CO2 세포배양기에 배양하고, 96 well, well 당 5×10³ cells 세포 수를 유지하며 배양하였다. 24시간 배양하고 난 후, 배양액 상층을 버리고 a-MEM(10% FBS, 50 ng/ml 함유) 배기로 치환하여 세포를 증식시킨 다음 TGFβ를 사용하였다.
(3) 세포독성(Cytotoxicity) 측정
대식세포와 비만세포에 대한 세포독성을 판단하기 위하여 MTT assay를 이용해 분석하였다. 세포를 96 well plate에 2×104 cells/well로 분주한 후, 24시간 동안 배양시킨 다음 RME를 농도별로 24시간 처리하였다. 24시간 동안 반응이 끝난 각 well에 EZ-CYTOX 10 µL를 첨가해준 뒤 30분 동안 incubator에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후 96 well plate를 450 nm에서 흡광도 최대치를 측정하였다. 실험에 사용한 배양배지 100 µL와 EZ-CYTOX 10 µL를 섞어 blank로 사용하였다. 측정 결과는 정상대조군을 100%로 하여 세포생존율을 백분율(%)로 비교하여 나타내었다.
(4) 항염증 효과 측정
항염증 효과는 대식세포에 LPS로 자극하여 생성된 NO의 양은 Griess reagent(1% sulfanilamide, 0.1% N-naphthylethylenediamine in 2.5% phosphoric acid)를 이용하였고 세포배양액 중에 형성된 양을 측정하였다. 1×105 cells/ml로 세포농도를 조정한 RAW 264.7 세포를 96 well에 분주하고 24시간 결합시킨 다음 1 μg/ml LPS와 RME를 농도별로 첨가하여 iNOS 활성을 유도하였다. 24시간 동안 5% CO2, 37 ℃ 조건하에서 incubation 한 뒤 동량의 Griess reagent를 가하여 혼합하고 15분 동안 방치한 후 최대 흡광도(550 nm)를 측정하고 그 비를 % 값으로 환산하였다.

2) RBL-2H3 비만세포에 대한 항알레르기 영향 측정

(1) RBL-2H3 비만세포 배양
비만세포인 RBL-2H3를 1% 우 태아 혈청 1%와 L-glutamine을 포함하는 DMEM를 이용하여 37 ℃, 수분이 있는 5% CO2 인큐베이터에서 배양시켰다. 이후 배양접시 면에 붙은 세포를 트립신-EDTA으로 처리하여 떼어낸 다음, 이를 원심분리로 침전시키고 이를 현탁하여 실험에 사용하여 얻어진 RBL-2H3 비만세포를 24 well에 각각 5×105 cell/well 농도로 분주한 후 monoclonal에 IgE 0.5 μg/ml를 첨가하여 12시간 배양기에서 세포를 증가시켰다. 세포를 0.5 ml의 siraganian buffer 완충제(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 40 mM NaOH, 0.4 mM MgCl2, 25 mM PIPES, pH7.2)로 세척하였다. 다음 0.16 ml의 siraganian buffer(5.6 mM glucose, 1 mM CaCl2, 0.1% BSA를 첨가)를 넣은 다음 10분간 37 ℃에서 배양하여 사용하였다.
(2) 비만세포의 과립 분비에 미치는 영향 측정
항알레르기 효과는 비만세포 탈과립으로 인한 β-hexosaminidase의 분비량을 측정함으로써 알레르기 반응이 억제 되는지 여부를 평가하였다. 비만세포를 24-well plates에 각 well당 5×105 cell/well씩 세포농도로 분주한 후, 12시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. anti-DNP-specific IgE를 최종 농도 200 ng/ml로 각 well에 감작시켜 추가로 12시간 배양하였다. IgE에 감작된 세포는 PIPES buffer로 37 ℃에서 두 번 세척하였고, PIPES buffer에 녹인 시료를 농도별로 37 ℃에서 30분 동안 처리하였다. 2시간 배양 후 HSA(1 ug/ml)를 처리하고 37 ℃에서 4시간 반응시켰다. 이후 반응을 정지시키기 위해 15분간 얼음 위에 두었다. β-hexosaminidase 분비량은 활성화 반응이 일어난 비만세포가 존재하는 well의 PIPES buffer 상층액과 P-nitrophenyl-N –acetyl- β-D-glucosaminide를 0.1 M citrate buffer (pH 4.5)에 녹인 용액을 96-well에서 혼합하고 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰고, 0.1 M carbonate buffer(pH 10.5)를 가하여 반응을 종결시킨 뒤, 405 nm에서 최대 파장으로 흡광도를 측정하였다.
(3) 비만세포의 IL-4 및 TNF-α 생성에 미치는 영향 측정
RBL-2H3 cells(3×106 cells)을 DMEM을 이용하여 37 ℃, 수분이 있는 5% CO2에서 배양하였다. 배양 plate에 부착된 세포를 trypsin-EDTA 액을 이용하여 분리한 다음, 원심 분리기를 이용하여 회수하고 재현탁시켜 실험에 사용하였다. RBL-2H3 세포를 24 well에 각각 5×105 cell/well로 분주한 후 monoclonal에 IgE 0.5 μg/ml를 첨가하여 12시간 배양시키면서 증감하였다. 세포를 0.5 ml의 siraganian buffer(40 mM NaOH, pH 7.2, 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 25 mM PIPES)로 씻어준 후 0.16 ml의 siraganian buffer(5.6 mM glucose, 1 mM CaCl2, 0.1% BSA를 첨가)를 넣은 다음 37 ℃에서 10분간 배양시켰다. 그 후, RME를 각각 0.04 ml를 가하고 20분 후에 0.02 ml의 antigen(DNP-BSA 1 μg/ml)으로 37 ℃에서 40분간 세포를 활성화 시키고 2,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여, 0.025 ml의 상등액을 96 well로 옮겼고, Endogen Elisa kit(USA)로 IL-4와 TNF-α를 측정하였다.

3) 염증관련 유전자 발현에 미치는 영향 측정

(1) total RNA 준비
RAW 264.7 cell을 LPS 처리하여 염증을 유도한 후 24시간 배양하고, 세포에 PBS를 넣고 세포를 분쇄한 다음, 1 ml TRIzol reagent(Invitrogen, USA)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 처리 분리된 RNA 함유용액에 200 μl의 chloroform : isoamylalcohol (24 : 1)을 넣고 진탕한 다음 14,000 rpm으로 원심분리기를 통하여 생성된 상등액 500 μl를 취하였다. 다시 0.5 ml isopropyl alcohol을 가하고 영하 20 ℃에서 24시간 방치하여 RNA침전물을 형성시킨 후 1,400 rpm으로 20분간 원심 분리하였다. 침전물을 제외한 용액을 제거하고 70% 에탄올로 세척하여 자연 건조시켰다. RNase free water에서 RNA를 녹인 후 RNase-free DNase를 첨가하고 -70 ℃에서 저장하였다. 비만세포인 RBL-2H3 세포도 같은 방법으로 RNA를 분리하여 -70 ℃에 보관하였다.
(2) PCR용 cDNA 준비
대식세포 및 비만세포에서 별도 준비한 total RNA액 1 μl에(1 μg RNA 함유)에 oligo dT(100 pmol) 1 μl, RNase free water 3 μl을 넣은 후 천천히 혼합한 다음, 65 ℃로 10분간 가온하였다. Primer가 annealing 하도록 4 ℃에서 약 5분간 식힌 다음, Reverse transcriptase buffer, dNTP(각 2.5 mM)와 RNase inhibitor, DTT(100 nM), Reverse transcriptase (M-MLV 200 U/μl)을 첨가한 후, 조심스럽게 혼합하였다. 이후 42 ℃에서 90분간 incubation 한 후, 95 ℃에서 5분간 가온한 후 사용하였다.
(3) Real time RT-PCR
각각의 optical tube(MicroAmpⓇ Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode and Optical Adhesive Films, Applied Biosystems, Cat.No. 4314320)에 3배의 SybrGreen Mix 2.5 μl(Sigma-Aldrich, Cat.No. S9430), (2)에서 준비한 cDNA 1 μl, 10 pmol/μl 농도의 primer pair mix 1 μl, 각각 2.5 mM의 dNTP 2 μl, 10xTag polymerase buffer 2.5 μl, Tag Polymerase 0.3 μl와 14.7 μl H2O를 넣고, 95 ℃ 5 min 1 cycle, 45 ℃ 30 sec, 95 ℃ 30 sec, 72 ℃ 60 sec 40 cycles, 95 ℃ 20 min 1 cycle로 증폭시켰다. PCR 반응을 종료 후에 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5 μl를 첨가하여 3% agarose gel에서 PCR specificity를 측정하였다. ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Cat.No. 4349157)를 사용하여 real time PCR 데이터를 분석하였다.

3. 통계 처리

실험결과의 통계적 유의성을 분석하기 위하여 SPSS ver. 19.0 소프트웨어(SPSS Inc. Chicago. IL. USA)를 이용하였다. 실험결과는 최소 3회 이상 실시하여 계산한 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었고, 통계학적 분석은 post-hoc test와 one-way analysis of varience(ANOVA)를 사용하였다. 통계학적 유의성은 p 값이 0.05 미만이 경우에 인정하였다.

Ⅲ. 결 과

1. RME의 항산화능 효과

RME의 항산화능을 DPPH radical 시약을 가지고 농도별로 측정하였다. 12.5 mg/mL에서도 83%의 DPPH 소거능이 있어 저농도에서도 항산화 효능이 우수하였다(Fig. 1).
Fig. 1
DPPH radical scavenging activity of RME.
50 : 50 ug/ml of RME
100 : 100 ug/ml of RME
150 : 150 ug/ml of RME
200 : 200 ug/ml of RME
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2. RBL-2H3에 대한 세포독성 결과

RBL-2H3에 대한 RME의 세포독성을 측정하기 위해 농도별로 처리한 후 24시간 후에 세포독성에 대한 영향을 확인하였다. RME에서는 세포독성이 나타나지 않았다(Fig. 2).
Fig. 2
Effect of RME on viability of RBL-2H3 cells.
C : normal
D : 100 ug/ml of dexamethasone
12.5 : 12.5 ug/ml of RME
25 : 25 ug/ml of RME
50 : 50 ug/ml of RME
100 : 100 ug/ml of RME
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3. RBL-2H3 비만세포에서 β-hexosaminidase 유리 억제 효과

RBL-2H3 세포에서 RME의 대한 항알레르기 효능을 측정하기 위해 HSA를 처리하여 탈과립 현상을 일으켜 RME을 농도별로 처리 후 beta-hexosaminidase의 분비를 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다(Fig. 3).
Fig. 3
Effect of RME on granule release in HSA- treated RBL-2H3 mast cells.
RBL-2H3 cells were activated by HAS and measured β-hexosaminidase level in cell incubated for 6 hours with RME.
N : normal
C : HSA only
25 : HSA+25 ug/ml of RME
50 : HSA+50 ug/ml of RME
100 : SA+100 ug/ml of RME
200 : HSA+200 ug/ml of RME
** : p<0.01 vs N, ## : p<0.01
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4. RBL-2H3 비만세포에서 IL-4 억제효과

Fig. 4는 본 연구에 따른 RME의 비만세포에서 알레르기 지표 성분인 IL-4 생합성을 억제하는 결과를 나타낸 그림이다. 농도 의존적으로 IL-4 생성이 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 4).
Fig. 4
Effect of RME on IL-4 synthesis in HSA- treated RBL-2H3 mast cells.
RBL-2H3 cells were activated by HAS and measured IL-4 level in medium incubated for 6 hours with RME.
N : normal
C : HSA only
D : HSA+100ug/ml of dexamethasone
25 : HSA+25 ug/ml of RME
50 : HSA+50 ug/ml of RME
100 : HSA+100 ug/ml of RME
** : p<0.01 vs N, ## : p<0.01
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5. RBL-2H3 비만세포에서 TNF-α 억제 효과

RME의 비만세포에서 알레르기 지표 성분인 TNF-α 생합성을 억제하는 실험에서는, 고농도에서 TNF-α 생성이 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 5).
Fig. 5
Effect of RME on TNF-α synthesis in HSA- treated RBL-2H3 mast cells.
RBL-2H3 cells were activated by HAS and measured TNF-α level in medium incubated for 6 hours with RME.
N : normal
C : HSA only
25 : HSA+25 ug/ml of RME
50 : HSA+50 ug/ml of RME
100 : HSA+100 ug/ml of RME
** : p<0.01 vs N, # : p<0.05 vs C
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6. Raw 264.7 세포에서 항염증 효과

Raw 264.7 세포에서 항염즘 효과를 측정하기 위해서 RME를 농도별로 처리한 후 LPS 1 μg/mL을 처리하여 18시간 후에 Grees 시약을 사용하여 NO 생성량에 미치는 영향을 측정하였다. 고농도에서 NO 생성량을 억제하여 항염증 효과를 보였다(Fig. 6).
Fig. 6
Effect of RME on LPS-induced NO synthesis in RAW 264.7 macrophage cells.
N : normal
C : LPS only
25 : LPS+25 ug/ml of RME
50 : LPS+50 ug/ml of RME
100 : LPS+100 ug/ml of RME
200 : LPS+200 ug/ml of RME
** : p<0.01 vs N, ## : p<0.01 vs C
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7. RAW 264.7 세포에 대한 세포독성 결과

RAW 264.7 대식세포에 대한 RME의 세포독성을 측정하기 위해 농도별로 처리한 후 24시간 후에 세포독성에 대한 영향을 확인하였다. RME에서는 세포독성이 나타나지 않았다(Fig. 7).
Fig. 7
Effect of RME on cell viability of RAW 264.7 cells.
C : normal
12.5 : 12.5 ug/ml of RME
25 : 25 ug/ml of RME
50 : 50 ug/ml of RME
100 : 100 ug/ml of RME
200 : 200 ug/ml of RME
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8. Raw 264.7 세포의 IL-1β 유전자 발현 억제 효과

Raw 264.7 세포에 RME을 농도별로 처리하였을 때 IL-1β 발현이 고농도에서 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 8).
Fig. 8
Effect of RME on LPS-induced IL-1β gene expression in Raw 264.7 cells.
N : normal
C : LPS only
50 : LPS+50 ug/ml of RME
100 : LPS+100 ug/ml of RME
200 : LPS+200 ug/ml of RME
** : p<0.01 vs N, ## : p<0.01 vs C
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9. Raw 264.7 세포의 iNOS 유전자 발현 억제 효과

Raw 264.7 세포에 RME를 농도별로 처리하였을 때 iNOS 발현이 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 9).
Fig. 9
Effect of RME on LPS-induced iNOS gene expression in Raw 264.7 cells.
N : normal
C : LPS only
50 : LPS+50 ug/ml of RME
100 : LPS+100 ug/ml of RME
200 : LPS+200 ug/ml of RME
** : p<0.01 vs N, ## : p<0.01 vs C
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10. Raw 264.7 세포의 IL-6 유전자 발현 억제 효과

Raw 264.7 세포에 RME를 농도별로 처리하였을 때 IL-6 발현이 고농도에서 감소되는 것을 확인하였다(Fig, 10).
Fig. 10
Effect of RME on LPS-induced IL-6 expression in Raw 264.7 cells.
N : normal
C : LPS only
50 : LPS+50 ug/ml of RME
100 : LPS+100 ug/ml of RME
200 : LPS+200 ug/ml of RME
** : p<0.01 vs N, ## : p<0.01 vs C
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11. Raw 264.7 세포의 IL-10 유전자 발현 억제 효과

Raw 264.7 세포에 RME를 농도별로 처리하였을 때 IL-10 유전자 발현 변화를 측정하였을 때 IL-10 발현에는 영향이 없음을 확인하였다(Fig. 11).
Fig. 11
Effect of RME on LPS-induced IL-10 expression in Raw 264.7 cells.
N : normal
C : LPS only
50 : LPS+50 ug/ml of RME
100 : LPS+100 ug/ml of RME
200 : LPS+200 ug/ml of RME
** : p<0.01 vs N
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12. Raw 264.7 세포의 TNF-α 유전자 발현 억제 효과

Raw 264.7 세포에 RME을 농도별로 처리하였을 때 TNF-α 발현을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다(Fig. 12).
Fig. 12
Effect of RME on LPS-induced TNFα expression in Raw 264.7 cells.
N : normal
C : LPS only
50 : LPS+50 ug/ml of RME
100 : LPS+100 ug/ml of RME
200 : LPS+200 ug/ml of RME
** : p<0.01 vs N, ## : p<0.01 vs C
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Ⅳ. 고 찰

알레르기 반응에서 핵심적인 역할을 하는 비만세포 표면에는 급격한 염증반응을 유발하는 대표적인 수용체로 알려진 FcεRI가 있어 항원- IgE 복합체가 결합하여 활성화되며, 일련의 신호전달을 통해 탈과립 과정을 유발한다16,17. 이때 histamine, β-hexosaminidase, serotonin, bradykinin등 이미 합성되어 저장되어 있던 매개물질이 tryptase, chymotryptase, proteoglycan 등과 동시에 방출 된다18. 이런 반응 단계에서 활성화된 신호가 지질성 염증 매개체들의 생합성을 촉진하게 되는데, 세포막 인지질로부터 PLA2의 작용으로 유리된 arachidonic acid가 COX 또는 LOX의 작용을 거쳐 변환된 형태인 Prostaglandins, Leukotriens, Thromboxane 등이 염증 매개 물질로 작용한다19,20. 이들은 Glycerophospholipids 유도체인 platelet activating factor 등 다양한 생리활성을 나타내는 신생 매개체들과 알레르기 반응인 급성 염증 반응에 관여한다21. 이와 함께, 비만세포의 활성화에 동반하여 RAS-RAF-MAPK와 같은 신호전달과정을 통해 나타나는 NF-κB와 같은 전사인자의 활성화를 통해 면역반응 조절인자로 알려진 IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, TNF-α 등의 cytokine을 생성하게 된다22. 이들의 작용으로 비만세포는 자가증식과 활성화를 촉진하는 동시에 다양한 면역세포의 활성을 자극하여 면역반응을 증폭시킨다23. 따라서 알레르기 관련 질환을 치료하거나 예방하기 위해서는 비만세포의 활성을 억제하거나 염증 반응 유발 세포인 대식세포를 비롯하여 호중구 호산구의 기능을 억제하는 것이 중요하다.
본 연구에서는 RME를 이용하여 알레르기성 염증반응에서 핵심적인 조절기능을 가지고 있는 비만세포와 대식세포의 활성을 억제하여 알레르기성 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 천연 물질 확보를 추구하였다, 본 연구에서 비만세포 활성화의 지표로 삼은 β-hexosaminidase는 비만세포나 호염구, 호염기구 등의 과립에 저장되어 있다가 IgE에 결합하는 알레르기 유발 항원이 존재할 때, 저장된 과립으로부터 histamine, tryptase 등과 함께 급격히 유리된다24. 따라서, β-hexosaminidase는 histamine과 함께 비만세포 활성화로 인한 탈과립의 지표로 사용되며, 과립 분비를 억제하는 물질은 항알레르기 효능이 있는 것으로 평가한다. 실험 결과, 알레르기 유발 물질인 HSA로 처리한 경우 RBL-2H3 비만세포 과립 매개물인 β-hexosaminidase 유리가 현저히 증가하였고, RME를 투여한 경우 HSA를 처리하여 증가된 과립 분비를 현저히 감소시켰다(Fig. 3). 이는 RME가 histamine 등으로 유발되는 알레르기성 질환을 억제할 것으로 추정되었다. 또한, HSA는 RBL-2H3 비만세포로부터 IL-4 및 TNF-α의 합성을 증가시켰으며, RME는 이들의 생성을 억제하였다(Fig. 4, 5). IL-4는 B세포를 분화, 활성화시켜 IgE 합성 증가를 유도하는 유일한 사이토카인으로25, 내피세포에서 생성되는 vascular cell adhesion molecule -1 발현을 증가시키고26, Th2 세포와 호산구의 분화를 촉진하기 때문에 IL-4 생성 억제는 알레르기 반응을 억제하는 가장 중요한 단계이다. 비만세포 활성화로 분비되는 TNF-α도 면역세포의 PGs 합성과 IL-6 생성, 내피세포 접착 단백질 등의 발현을 통해 과민성 염증반응을 증가시킨다. 이와 별도로 IL-10은 B 세포의 IL-4를 억제하는 사이토카인으로 보고되었다25. 그러나, RME는 IL-10의 생성은 억제하지 않고 오히려 증가시키는 경향을 나타냈다(Fig. 11). 결과적으로, RME는 TNF-α, IL-4 생성과 작용을 억제하여, 비만세포 활성과 염증반응에 관여하는 면역세포의 기능을 억제하는 것으로 나타났다.
항알러지에 대한 반응은 위의 β-hexosaminidase 등으로 확인하였으나, 알러지에 속발된 염증에 대한 반응은 histamine 유도 또는 LPS 유도의 대식세포 반응으로 실험할 수 있는데, 본 실험에서는 LPS유도 대식세포의 염증에 대한 반응을 평가하였다. 대식세포는 활성화 단계에서 다양한 염증관련 물질을 생성하며, 분비하여 다른 면역세포들의 기능을 조절하는 역할을 한다. 또한, ROS 와 RNS를 이용하여 탐식되는 이물질을 분해한다27. 대식세포 활성화는 toll-like receptor-4와 같은 수용체를 통해 pathogen associated molecular pattern, damage associated molecular pattern와 같은 표면에 일정한 패턴을 가진 항원을 인식하여 결합하거나 비만세포 등 다른 면역 세포로부터 유리된 cytokine의 자극으로 시작된다28. LPS는 표면수용체와 결합할 수 있는 대표적인 세균의 세포 표면 성분으로 대식세포를 활성화하고 inducible nitrogen oxide syjthetase 작용을 통해 nitrogen oxide의 생성을 촉진한다29. 이는 대식세포에 의해 탐식된 외부 물질의 분해를 촉진하는 결과로 염증반응의 주요한 단계이다. 또는 LPS 유도 등이 있으나, 된 대식세포의 NO 생성을 저해시켜 염증을 억제하는 것으로 판단되었다(Fig. 6). 또 RME는 LPS에 의해 유도된 IL-1β, iNOS, IL-6와 TNF-α 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 8, 9, 10, 12). IL-1β은 TNF-α, IL-6 등과 함께 장기 조직에 상해를 유발하는 세포 상해성 염증반응을 증폭시키는 역할을 한다. 따라서, RME에 의한 관련 인자들의 발현 억제는 iNOS 발현과 NO 생성을 저해하여 염증을 억제한 Fig 6의 결과와 상응한다.
결론적으로, RME는 비만세포의 과립 분비와 TNF-α, IL-4 생합성을 억제하여 비만세포 기능을 억제하였고, 또한 대식세포의 염증관련 인자들의 발현 및 합성을 억제하였다. 따라서, RME 염증성 질환을 억제할 것으로 판단되며, 특히 알러지 질환에 대한 진달래 뿌리의 본초학적인 활용범위가 확장 될 것으로 기대된다.

V. 결 론

RME을 이용하여 알레르기성 염증에 미치는 영향을 측정하기 위한 연구를 수행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1. RME는 RBL2H3 비만세포에서 β-hexosaminidase 분비를 억제하였다.
2. RME는 RBL2H3 비만세포에서 IL-4, TNF-α 생성을 억제하였다.
3. RME는 RAW264.7 대식세포에서 NO 생성을 억제하였다.
4. RME는 RAW264.7 대식세포에서 IL-1β, iNOS, IL-6, TNF-α 유전자 발현을 억제하였다.
5. RME는 RAW264.7 대식세포에서 IL-10 발현에는 영향이 없었다.
이상의 결과, RME는 비만세포의 기능을 억제하고, 대식세포 활성을 억제하여 알레르기 반응으로 인한 염증성 질환을 억제할 것으로 판단되었다.

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