이 논문은 2018년도 원광보건대학교 교내연구비 지원에 의해서 수행됨.
Wild ginseng pharmacopuncture is widely used in oriental medicine. However, there is no standard method for efficiently extracting the active ingredient. In this study, in order to determine an efficient extraction method, wild ginseng was extracted by the distillation and 70% ethanol reflux methods, respectively. In comparing each extract, the index compounds were analyzed, and antioxidant activity was measured.
The index compounds, ginsenoside Rg1 and ginsenoside Rb1, were detected using high performance liquid chromatography (HPLC). Antioxidative activities of total phenolic compounds, DPPH (α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl), ABTS (2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)) and FRAP (ferric reducing antioxidant power) were measured to compare their bioactivities. Since saponin is known to be hemolytic, the hemolytic activity of each extract was compared.
The index compounds were analyzed. Nothing was detected in the wild ginseng distilled extracts (WGDE). In the wild ginseng 70% ethanol reflux extracts (WGEE), ginsenoside Rg1 was 3.66 mg/g, and ginsenoside Rb1 was 16.70 mg/g. WGEE showed higher levels than WGDE in all antioxidative activities. In the hemolytic test, the extracts showed almost no toxicity, but WGEE showed lower toxicity than WGDE.
In this study, it was concluded that WGEE is more advantageous than WGDE in the detection of index compounds and bioactivity. However, additional studies of additional extraction methods and other bioactivity tests are needed.
산삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 오갈피과 (Araliaceae)에 속하는 인삼이 야생상태에서 자연발아하여 성장한 삼을 말한다
산양산삼은 천방농산(충청남도, 한국)에서 재배된 10~12년근을 구입하였다. 추출에 사용된 주정은 (주)대정화학(시흥, 한국)에서 생산한 1급 시약을 사용하였다(Lot No. 140613). 감압농축기는 EYELA사(TOKYO, Japan)의 N2110 모델을 사용하였고, 동결건조기는 일신바이오베이스사(경기도, 한국)의 DF8503 모델을 사용하였다. 분석에 사용된 HPLC는 Agilent사(USA)의 1260 Infinity II LC system이었으며 이동상 제조에 사용된 water, acetonitrile(ACN), Methanol(MeOH)은 HPLC grade(J. T. Baker, phillipsburg, NJ, USA)를 사용하였다. 항산화 실험 및 용혈성실험을 위하여 사용된 microplate reader는 Biotek사(Winooski, USA)의 Epoch2였다. Folin-Ciocalteau reagent, gallic acid, quercetin, 2,2ˊ-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2ˊ-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline 6 sulfonic acid) diammonium salt(ABTS), potassium persulfate, 2,4,6-tripyridyl s triazine(TPTZ), (±)-6 -hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2 carboxylic acid(Trolox), iron(III) chloride hexahydrate(FeCl3⋅6H2O), sodium acetate trihydrate, ascorbic acid는 Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)에서 구입하였고, Na2CO3, diethyleneglycol, acetic acid는 Junsei(Tokyo, Japan), NaOH는 삼전(평택, 한국), HCl는 SK 케미컬(서울, 한국)에서 각각 구입하였다.
WGDE의 추출은 증류추출기를 이용하였다. 100 g의 건조된 산양산삼에 1 L의 증류수를 넣고 3시간 환류추출로 전탕하였다. 전탕 후 환류추출기에 냉각수 공급을 중단한 후 증발되는 수증기를 포집 액화하여 검액으로 사용하였다. 실험 전까지 냉장상태로 보관하였다. WGEE은 100 g의 건조된 산양산삼에 1 L의 70% 주정을 넣고 3시간 환류추출 하였다. 추출액을 여과한 후 여액을 감압농축하고 80%, 90% 주정을 이용하여 알코올 수침하여 정제하였다. 여과 후 동결건조하고 실험전까지 분말상태로 냉동보관 하였다.
산양산삼의 지표성분 분석은 대한약전 의약품 각조 제 2부의 인삼 항목에 따라 분석법을 설정하였다. C18(4.6×250 mm, 5 μm, Agilent) 컬럼을 사용하였고 검출기는 UV 203 nm이며 유속은 1 mL/min 였다. 기기 주입 볼륨은 모두 10 μL로 하였다. 그 외의 분석조건은 Ginsenoside Rg1과 Rb1이 차이가 있었다. Ginsenoside Rg1(Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, USA) 분석은 컬럼온도 30°, 이동상은 25% ACN을 사용하였고 표준품의 순도는 97.5%였다. Ginsenoside Rb1(Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, USA)은 컬럼온도 40°, 이동상은 30% ACN을 사용하였고 표준품의 순도는 100.0%였다. WGDE는 추출 후 원액을 그대로 사용하였으며, WGEE는 0.1006 g/mL의 농도로 기기분석 하였다. 분석 후 각 성분의 함량은 다음과 같은 공식으로 계산하였다.
WGDE는 증류로 얻은 산물을 원액, 2희석, 4희석하여 사용하였으며, WGEE는 8, 4, 2 mg/mL로 증류수에 녹여 사용하였다.
WGDE와 WGEE에 함유되어 있는 총 페놀 함량은 비색법
라디칼 소거활성은 안정한 라디칼 DPPH를 사용하는 방법으로 측정하였다
ABTS 라디칼 소거능을 이용한 시료의 항산화측정은 Arnao 등의 방법
Fe3+을 Fe2+로 환원시키는 능력을 측정하는 FRAP 기법은 Bemzie
용혈성 시험은 이 등의 방법
(%) 용혈성(Hemolysis)=[(S-D)/(T-D)]×100
S : 시료첨가구 흡광도
D : DMSO첨가구 흡광도
T : Triton X-100 첨가구 흡광도
실험결과는 3회 반복 측정한 후 평균±표준편차로 나타냈으며, 통계적인 평가는 independent t-test로 검정하였다. p값이 0.05보다 작을 때 유의한 것으로 평가하였다.
WGDE는 100 g의 산양산삼을 1 L의 증류수로 추출하여 가능한 모든 용액을 증류액으로 하였으며 증류수를 가하여 총 1 L로 하였다. WGEE는 100 g의 산양산삼을 70% 주정으로 추출하였고 여과 후 80%, 90% 주정 처리하여 정제한 후 총 8.03 g의 동결건조 분말을 얻었다(
Yield of Wild Ginseng Extracts
Extraction methods | Raw material (g) | Final product (L, g) | Yield (%) |
---|---|---|---|
Distillation extraction method | 100 | 1 L | 100 |
70% EtOH reflux extraction | 8.03 g | 8.03 |
대한약전 상 지표성분인 ginsenoside Rg1과 Rb1을 HPLC-UV를 이용하여 분석하였다. WGDE는 각각의 지표성분이 전혀 검출되지 않았으며, WGEE는 ginsenoside Rg1은 3.66 mg/g, ginsenoside Rb1은 16.70 mg/g이 검출되었다(
HPLC chromatogram on ginsenoside, the index compound, WGDE and WGEE.
(A) chromatogram of ginsenoside Rg1, (B) chromatogram of ginsenoside Rb1
WGDE와 WGEE의 총 페놀화합물의 함량을 gallic acid에 비례하여 측정한 결과, WGDE는 원액, 2희석, 4희석에서 각각 16.38±0.39, 16.19±0.26, 12.95±0.23 μg/mL이었으며 WGEE는 8.0, 4.0, 2.0 mg/mL에서 각각 119.31±1.94, 110.95±4.29, 70.22±1.56 μg/mL의 값을 보였다. 추출법 별 동일한 용량에서 WGEE가 유의적으로 높은 함량을 보였다(
Extraction method changes in total Phenolic compounds of Wild Ginseng extracts.
Data are expressed as mean±SD of triplicate experiments.
WGDE : Wild Ginseng distilled extracts, WGEE : Wild Ginseng 70% Ethanol extracts, mg gallic acid equivalent per g dry weight
*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 indicating statistically significant difference
WGDE와 WGEE의 DPPH를 이용한 전자공여능의 정도를 trolox에 비례하여 측정하였다. WGDE는 원액, 2희석, 4희석에서 각각 13.94±0.83, 6.02±0.81, 4.94±0.64 μg/mL이었으며 WGEE는 8.0, 4.0, 2.0 mg/mL 에서 각각 35.39±2.44, 27.88±1.75, 15.32±1.08 μg/mL의 값을 보였다. 추출법 별 동일한 용량에서 WGEE가 유의적으로 높은 함량을 보였다(
Extraction method changes in (A) DPPH free radical scavenging, (B) ABTS free radical scavenging, (C) ferric reducing anti-oxidative activity of Wild Ginseng extracts.
Data are expressed as mean±SD of triplicate experiments. WGDE : Wild Ginseng distilled extracts, WGEE : Wild Ginseng 70% Ethanol extracts, mg trolox equivalent per g dry weight
*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 indicating statistically significant difference.
WGDE와 WGEE의 ABTS를 이용한 전자공여능의 정도를 trolox에 비례하여 측정하였다. WGDE는 원액, 2희석, 4희석 중 2희석액에서만 0.01±5.40 μg/mL의 활성을 보였으며, WGEE는 8.0, 4.0, 2.0 mg/mL 에서 각각 171.05±6.46, 90.75±8.47, 66.28±11.41 μg/mL의 값을 보였다. 추출법 별 동일한 용량에서 WGEE가 유의적으로 높은 함량을 보였다(
WGDE와 WGEE의 철이온에 대한 환원력의 정도를 trolox에 비례하여 측정하였다. WGDE는 원액, 2희석, 4희석에서는 활성을 전혀 보이지 않았으며 WGEE는 8.0, 4.0, 2.0 mg/mL에서 각각 99.13±3.41, 43.38±3.84, 28.90±0.65 μg/mL의 값을 보였다(
WGDE와 WGEE의 농도별 적혈구의 용혈성을 비교하기 위하여 먼저 Triton X-100로 100% 용혈 시키는 최소의 농도를 설정하고 그 농도의 흡광도 값과 시료를 처리하였을 때의 흡광도 값을 비교하여 표현하였다. WGDE는 원액, 10배 희석, 102배 희석, 103배 희석, 104배 희석액에서 각각 3.09±0.37, 2.72±0.27, 2.67±0.22, 2.60±0.27, 2.45±0.15%였으며, WGEE는 8, 0.8, 0.08, 0.008, 0.0008 mg/mL 농도에서 각각 1.56±0.17, 1.30±0.11, 1.25±0.27, 1.10±0.13, 1.03±0.15%의 용혈성을 보였다. WGDE와 WGEE는 높은 용혈성을 보이지 않았으나, WGDE가 더 낮은 용혈정도를 보였다(
Comparison of hemolysis of red blood cell between WGDE and WGEE.
WGDE : Wild Ginseng distilled extracts, WGEE : Wild Ginseng 70% Ethanol extracts.
최근에는 불완전한 암치료보다 암 예방 효과와 관련된 새로운 약물연구 및 제형개발에 많은 노력을 기울이고 있다. 특히 천연물은 비교적 부작용이 적기 때문에 암치료제로서 부각되고 있다